COVID-19患者のSARS-CoV-2検出には、唾液の方が鼻咽頭スワブよりも感度が高いという論文和訳

少し前に有名になった、COVID-19患者のSARS-CoV-2検出には、唾液の方が鼻咽頭スワブよりも感度が高いという論文についてDeepL翻訳して手直ししたのでメモとして残しておきます(問題あったら消します)。

なお、この論文はプレプリントであり、査読を受けていません。この論文は、まだ評価されていない新しい医学研究を報告しているため、臨床実践の指針とすべきではありません。2020年5月5日現在。→アクセプトされ、2020年8月28日にNEJMで公開されました。

翻訳元
Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs

タイトル
COVID-19患者のSARS-CoV-2検出には、唾液の方が鼻咽頭スワブよりも感度が高い

要旨
迅速かつ正確な SARS-CoV-2 診断検査は、進行中の COVID-19 パンデミックを制御するために不可欠である。COVID-19 診断のための現在のゴールドスタンダードは、鼻咽頭スワブからの SARS-CoV-2 のリアルタイム RT-PCR 検出である。しかし、感度の低さ、医療従事者への曝露リスク、および世界的な綿棒および個人用保護具の不足により、新しい診断アプローチの検証が必要とされている。唾液は SARS-CoV-2 診断法の有望な候補である。その理由は、（1）採取が低侵襲であり、確実に自己投与が可能である事（2）唾液は、以前の研究では、流行性のヒトコロナウイルスを含む他の呼吸器病原体の検出において、鼻咽頭スワブに匹敵する感度を示した事 である。SARS-CoV-2 検出のための唾液の使用を検証するために、我々 は COVID-19 患者と COVID-19 病棟の医療従事者から自己採取したサンプルを確認した COVID-19 からの鼻咽頭および唾液サンプルをテストした。患者にマッチした患者の鼻咽頭および唾液サンプルからの SARS-CoV-2 検出を比較したところ、唾液の方が検出感度が高く、感染の経過を通して一貫性があることがわかった。さらに、我々は唾液の自己サンプル収集の変動が少ないことを報告する。まとめると、我々の調査結果は、唾液が実行可能で、鼻咽頭スワブのより敏感な代替であり、正確で大規模な SARS-CoV-2 テストのための自宅での自己投与サンプル収集を可能にする可能性があることを示している。

序論
COVID-19パンデミックの原因となる新型コロナウイルスであるSARS-CoV-2を制御するための努力は、正確で迅速な診断検査に依存している。これらの検査は、（1）効果的な自己隔離を促進し、ハイリスクグループ内での感染を減少させるために、軽症および無症候性の感染に対して感度が高く、（2）病気の進行を確実にモニターし、臨床的な判断を助けるために一貫性があり、（3）社会的な距離の取り方が安全に緩和される場合など、地域および国の公衆衛生政策に情報を提供するために拡張可能でなければならない。しかし、現在の SARS-CoV-2 検査戦略は、リアルタイム RT-PCR のために広く推奨されているサンプルタイプとして鼻咽頭スワブに依存していることもあり、これらの基準を満たしていないことが多い。
鼻咽頭スワブは呼吸器ウイルス診断に一般的に使用されているが、感染初期の SARS-CoV-2 検出には比較的感度が悪く、連続検査では一貫性がない。さらに、鼻咽頭スワブの採取は、手順が侵襲性であるために患者に不快感を与え、繰り返し検査のコンプライアンスを制限し、患者のくしゃみや咳を誘発してウイルス粒子を排出するため、医療従事者に大きなリスクをもたらす。また、医療従事者のための綿棒や個人用保護具が広く不足しており、鼻咽頭綿棒の自己採取は困難であり、ウイルス検出の感度が低いため、この方法は大規模な検査には適していない。これらの課題は、COVID-19のパンデミックが低所得国で激化するにつれて、さらに悪化することが予想される。これらの限界を考えると、より信頼性が高く、資源をあまり消費しないサンプル採取方法、理想的には家庭での自己採取を可能にする方法が緊急に必要とされている。

唾液サンプリングは、唾液の収集が非侵襲的で自己投与が容易なので、鼻咽頭スワブに代わる魅力的なものである。鼻咽頭と唾液の RT-PCR 検出のための鼻咽頭と唾液のコンコーダンスの分析は、2 つの季節性ヒト コロナウイルスを含む呼吸器病原体の検出のため、2 つのサンプル タイプ間の同等の診断感度を示唆している。予備的な知見は、（1）SARS-CoV-2はCOVID-19患者の唾液から検出することができ、（2）自己採取した唾液サンプルは、軽度および不顕性COVID-19症例から医療従事者によって収集された鼻咽頭スワブと同等のSARS-CoV-2検出感度を持っていることを示している。しかし、決定的なことに、鼻咽頭スワブに対する唾液中の SARS-CoV-2 検出感度の厳密な評価は、COVID-19 感染の経過中の入院患者からは行われていない。

この研究では、COVID-19感染の入院患者およびCOVID-19曝露の中等度から高リスクの無症候性医療従事者から収集した対になった鼻咽頭スワブおよび唾液サンプルにおけるSARS-CoV-2検出を評価した。我々の結果は、SARS-CoV-2検出のために唾液を使用することは、鼻咽頭スワブを使用するよりも感度が高く、一貫性があることを示している。
全体的に、我々は、唾液がCOVID-19検査の要求を軽減するための信頼性の高いサンプルタイプとして考慮されるべきであることを示している。

結果
入院患者の鼻咽頭スワブよりも唾液から検出されたSARS-CoV-2価の方が高い 。
唾液が米国CDCの推奨する使用方法と同様の性能を発揮するかどうかを判断するには
SARS-CoV-2 診断のために鼻咽頭スワブを採取し、COVID-19 入院患者 44 名から臨床サンプルを採取した（表 1）。このコホートは重症の COVID-19 患者の範囲を表しており、2020 年 4 月 5 日現在、集中治療を必要とする 19 例（43%）、機械的換気を必要とする 10 例（23%）、および死亡した 2 例（5%）であった。米国のCDC SARS-CoV-2 RT-PCRアッセイを用いて、自己採取した121人の唾液または医療機関のこのコホートから、ワーカーが投与した鼻咽頭スワブを採取した。我々は、以下のような強い米国CDCの "N1 "と "N2 "のプライマープローブセット（拡張データ図1）の一致を確認したため、"N1 "セットのみを用いてウイルス力価（ウイルスコピー/mL）を算出した。
1）を用いて、"N1 "セットのみを用いてウイルス力価（ウイルスコピー/mL）を計算しました。すべての陽性サンプル（n = 46の鼻咽頭、37の唾液）から、我々は、唾液からの幾何学的平均ウイルス力価が鼻咽頭スワブよりも約5⨉高いことを発見した（p < 0.05、Mann-Whitney検定、図1a）。患者とマッチした鼻咽頭および唾液サンプル（各サンプルタイプの n = 38）のみに分析を限定すると、唾液からの SARS-CoV-2 の力価が鼻咽頭スワブよりも有意に高いことがわかった（p = 0.0001、Wilcoxon 検定、図 1b ）。さらに、我々は 8 つの一致するサンプルから唾液から SARS-CoV-2 を検出したが、鼻咽頭スワブからは検出しなかった（21%）一方で、我々は 3 つの一致するサンプルから唾液ではなく鼻咽頭スワブからのみ SARS-CoV-2 を検出した（8%、図 1c）。全体的に、入院患者の鼻咽頭スワブよりも唾液からの SARS-CoV-2 の力価が高いことがわかった。

表 1. COVID-19入院患者コホートの特徴

 

図 1. SARS-CoV-2 の力価は、入院患者からの鼻咽頭スワブよりも唾液中の方が高い。( a ) すべての陽性の鼻咽頭スワブ ( n = 46) と唾液サンプル ( n = 39) を Mann-Whitney 検定 ( p < 0.05) で比較した。棒グラフは中央値と95％CIを示す。米国CDC "N1 "アッセイを使用してSARS-CoV-2のための我々のアッセイ検出限界は、サンプルの5,610ウイルスコピー/mLに対応するサイクル閾値38である（点線と灰色の領域として示されている）。( b ) 患者にマッチしたサンプル（n = 38）を、接続線で表され、Wilcoxon検定（p < 0.05）で比較した。( c ) 患者一致標本（n = 38）も散布図で表されています。生のサイクルしきい値を含む、この図を生成するために使用されたすべてのデータは、補足データ1に記載されています。拡張データ 図1は、US CDCアッセイ "N1 "と "N2 "の結果の間の相関関係を示している。

入院患者の唾液を検査した場合のSARS-CoV-2の時間的変動の少なさ
鼻咽頭スワブからの一時的な SARS-CoV-2 診断テストは可変性があると報告されているため、我々は入院患者からの縦断的な鼻咽頭および唾液サンプルをテストし、どちらのサンプルタイプがより一貫した結果を提供するかを決定した。複数の鼻咽頭スワブを採取した22名と複数の唾液サンプルを採取した12名の参加者から、SARS-CoV-2の力価は一般的に両方のサンプルタイプで症状発症日の報告後に低下することがわかった（図2a）。我々の鼻咽頭スワブの結果は、SARS-CoV-2の力価と結果が変化するという以前の報告と一致している：我々は、参加者の鼻咽頭スワブがSARS-CoV-2の陰性であった5つのインスタンスを発見し、その後、次のコレクション中に陽性の結果が得られた（5/33リピート、33％; 図2b）。しかし、12人の患者からの縦断的な唾液採取では、サンプルが陰性で、その後に陽性結果が出た例は無かった。真の陰性の検査結果は、臨床家が患者の改善を追跡し、退院に関する意思決定をするために重要であるように、我々のデータは、唾液は、SARS-CoV-2価の時間的変化を監視するための鼻咽頭スワブよりも一貫性のあるサンプルタイプであることを示唆している。

 図 2：SARS-CoV-2 の検出は、唾液を用いた繰り返しのサンプル採取の間で変動が少ない。
a）唾液または鼻咽頭スワブからの縦断的な SARS-CoV-2 の力価は、症状発症からの日数として示されている。各円は個別のサンプルを表し、破線で同じ患者からの追加サンプルに接続されている。米国CDC "N1 "アッセイを使用したSARS-CoV-2のアッセイ検出限界は、サンプルの5,610ウイルスコピー/mLに対応するサイクル閾値38にある（点線と灰色の領域として示されている）。( b ) データはまた、収集ポイント間のウイルス力価の違いを強調するために、サンプリングの瞬間（連続した収集時間）によって示されている。生のサイクル閾値を含む、この図を生成するために使用されたすべてのデータは、補足データ1に記載されている。


唾液を使用した医療従事者からのより一貫性のある自己サンプリング
不顕性SARS-CoV-2感染症の検出のための唾液の検証は、遠隔患者診断と医療従事者の監視の両方のために変革的であることを証明することができる。これを調査するために、私たちは 98 人の無症状の医療従事者を私たちの研究に登録し、唾液および/または鼻咽頭スワブを平均 2.9 日ごとに収集した (範囲 = 1～8 日、表 2 )。今日までに、我々は、米国CDC "N1 "と "N2 "テストの両方を使用して鼻咽頭スワブによって陰性であり、任意の症状を報告しなかった2人の医療従事者からの唾液中のSARS-CoV-2を検出した。これらの個人の1人からの唾液は、2日後の再検査時に一致する陰性の鼻咽頭スワブと一緒に再び陽性をテストした。無症状の医療従事者の唾液からのウイルス力価は、私たちが一般的に症状のある入院患者から検出するものよりも低くなっている（図3a）、これはおそらく症状が出ていないことを裏付けていると思われる。


我々の限られたデータでは、唾液は無症状または無症状前の感染症を検出するためにより感度が高いかもしれないことを支持している；しかしながら、確認するためにはより大きなサンプルサイズが必要である。鼻咽頭スワブのサンプリングの不一致が偽陰性のための潜在的な問題の 1 つであるかもしれないように ( 図 2 )、適切なサンプルの収集のための内部管理、ヒト RNase P を監視し、代替の評価技術を提供する可能性がある。ヒトRNase Pの検出は、入院患者と医療従事者の両方のコホートで唾液からの方が優れていたが（図3b）、これだけではウイルス検出が優れているとは言えないかもしれない。さらに重要なことは、入院患者から採取した鼻咽頭スワブ（p = 0.0001、分散のための F 検定）と医療従事者から採取した自己採取の鼻咽頭スワブ（p = 0.0002; 図 3b）からヒト RNase P の検出がより多様であることを発見したことである。我々の結果は、唾液も適切で、おそらくより感度の高い、鼻咽頭スワブの代わりに、無症候性または症候性前の SARS-CoV-2 感染症のスクリーニングのための代替であることを示唆している。


表 2. 医療従事者のコホート

図 3. 唾液は、医療従事者および無症候性症例からの SARS-CoV-2 スクリーニングのための代替手段である。( a ) 医療従事者および入院患者の唾液から測定した SARS-CoV-2 の力価。US CDC "N1 "アッセイを使用したSARS-CoV-2のアッセイ検出限界は、サンプルの5,610ウイルスコピー/mLに対応するサイクルスレッショルド38である（点線と灰色の領域として示されている）。入院患者（左のパネル）または医療従事者（右のパネル）のいずれかからのヒトRNase PのためのRT-PCRサイクル閾値（Ct）値、およびサンプル収集のための内部コントロールを、F検定を使用して分散（入院患者のためのp = 0.0001;医療従事者のためのp = 0.0002）で比較した。生のサイクル閾値を含む、この図を生成するために使用されたすべてのデータは、補足データ1に記載されている。

考察
我々の研究は、唾液が SARS-CoV-2 検出のための鼻咽頭スワブに代わる実行可能で好ましい代替品であることを示している。我々 は、唾液からの SARS-CoV-2 検出の感度は、初期の入院で鼻咽頭スワブより優れていない場合は、同等であり、長期入院と回復の間により一貫性があることを発見した。さらに、陰性の一致した鼻咽頭スワブにもかかわらず、2 人の無症状の医療従事者の唾液から SARS-CoV-2 の検出は、唾液も軽度または不顕性感染症を識別するための実行可能な代替手段である可能性があることを示唆している。さらなる検証では、唾液サンプリングの広範な実装は、公衆衛生の努力のために変革的である可能性がある：唾液自己収集は、医療従事者と患者の相互作用、いくつかの主要なテストのボトルネックと全体的な院内感染リスクのソースのための直接の必要性を否定し、綿棒と個人的な保護具の供給需要を軽減する。

SARS-CoV-2のウイルス負荷は軽症例と重症例で異なるため、本研究の限界は、重症患者が多いCOVID-19入院患者に主に焦点を当てていることである。病院での唾液の有効性をより厳密に比較するには、より多くのデータが必要だが、最近の 2 つの研究からの知見は、無症状の個人と外来患者の両方から SARS-CoV-2 を検出するためのその可能性を裏付けている。COVID-19患者の唾液から感染性ウイルスが検出されているため、無症状前の個人の唾液中のウイルスゲノムコピーと感染性ウイルス粒子の関係を確認することは、無症状感染の動態を理解する上で重要な役割を果たすことになるだろう。

無症候性の個人におけるSARS-CoV-2検出の有望な結果に基づいて、唾液SARS-CoV-2検出アッセイはすでに米国食品医薬品局の緊急使用許可を通じて承認を得ている。 しかし、増大するテストの需要を満たすために、認定された臨床検査室でSARS-CoV-2診断用の唾液を即座に検証および実装する必要性をサポートする。

方法
倫理学
すべての研究参加者は、イェール大学HIC承認のプロトコール#2000027690に従って登録され、サンプリングされた。人口統計、臨床データおよびサンプルは、研究参加者が研究プロトコルを理解し、インフォームドコンセントに署名した後にのみ収集された。すべての参加者情報とサンプルは、研究の識別子に関連して収集された。

参加者登録
入院患者
Yale New Haven Hospital（米国コネチカット州ニューヘイブンにある 1541 床の三次医療センター）に入院した患者で、鼻咽頭および／または口腔スワブ（CDC が承認した測定法）で SARS-CoV-2 が陽性と判定された患者を本研究への登録に招待した。除外基準は、18歳未満の年齢、英語を話さないこと、発熱や呼吸器症状の非感染性の原因、または症状のための呼吸器以外の微生物学的に確認された感染源（消化管、尿、心血管など）の臨床的、放射線学的、実験的証拠があること、およびCOVID-19感染の疑いがないことであった。

医療従事者
COVID-19患者に職業的に曝露された無症状の医療従事者（例：発熱や呼吸器症状がない）は、本試験への登録を求められた。研究への参加により、曝露後の早期発見を確実にし、他の医療従事者および患者をさらに保護するための積極的なサーベイランスが可能となった。

サンプル収集
入院患者
鼻咽頭および唾液サンプルは臨床経過中 3 日ごとに採取した。鼻咽頭サンプルは、BDユニバーサル・ウイルス・トランスポート（UVT）システムを使用して、正看護師が採取した。柔軟性のあるミニチップの綿棒を患者の鼻孔から後鼻咽頭に達するまで通し、分泌物を吸収するために数秒間その場に置いた後、回転しながらゆっくりと取り除いた。綿棒を滅菌したウイルス輸送媒体（総容量3mL）に入れ、しっかりと密封した。唾液サンプルは患者が自己採取した。起床時、患者は、サンプルが採取されるまで、食物、水、および歯磨きを避けるように求められた。患者は、滅菌した尿カップに液体（気泡を除く）が約3分の1になるまで繰り返し唾液を吐いてもらい、しっかりと密閉した。すべてのサンプルは室温で保存され、サンプル採取から5時間以内にエール大学公衆衛生学部の研究室に運ばれた。

医療従事者
医療従事者は、2週間の期間、3日ごとに自己投与の鼻咽頭スワブと唾液サンプルを収集するように求められた。サンプルは、研究室に輸送されるまで+4℃で保管された。

SARS-CoV-2検出
研究室への到着時に、全核酸を、MagMAXウイルス/病原体核酸単離キット（ThermoFisher Scientific）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、鼻咽頭スワブからの300μlのウイルス輸送媒体または300μlの唾液全体から抽出し、75μlの溶出緩衝液に溶出させた。SARS-CoV-2 RNA検出のために、5μlのRNAテンプレートを、2019-nCoV_N1および2019-nCoV_N2のための米国CDCリアルタイムRT-PCRプライマー/プローブセット、および抽出コントロールとしてのヒトRNase P（RP）を用いて、以前に記載したように試験した。N1 と N2 の両方のプライマー・プローブセットが検出された場合、サンプルは SARS-CoV-2 の陽性と分類された。ウイルスコピーは、以前に作成したRNA転写物の10倍希釈標準曲線を用いて定量した。N1とN2の結果が比較可能であったので（拡張データ図1）、すべてのウイルスコピーは、N1プライマープローブセットを使用して計算されたものとして示されている。

統計解析
統計解析は「結果」に記載の通り、GraphPad Prism 8.0.0で行った。

謝辞
研究参加者の時間と研究への献身に感謝します。この研究を可能にしたイェール・ニューヘブン病院の臨床チームのメンバー全員に感謝します。また、技術的な議論をしてくれたS. TaylorとP. Jackにも感謝します。

資金調達
この研究はYale Institute for Global Healthから部分的に資金提供を受けた。対応する著者は、この研究のすべてのデータに完全にアクセスすることができ、出版のために提出するかどうかの決定について最終的な責任を負っていた。

拡張データ

拡張データ 図1 US CDC "N1" および "N2" プライマーおよびプローブセットを使用した SARS-CoV-2 検出の一致。Ct = RT-PCR サイクル閾値。点線とグレーの領域は検出限界を示す。


コピーした元の文章(翻訳しやすいように注釈を除いたもの)

Saliva is more sensitive for SARS-CoV-2 detection in COVID-19 patients than nasopharyngeal swabs

 Abstract
Rapid and accurate SARS-CoV-2 diagnostic testing is essential for controlling the ongoing COVID-19 pandemic. The current gold standard for COVID-19 diagnosis is real-time RT-PCR detection of SARS-CoV-2 from nasopharyngeal swabs. Low sensitivity, exposure risks to healthcare workers, and global shortages of swabs and personal protective equipment, however, necessitate the validation of new diagnostic approaches. Saliva is a promising candidate for SARS-CoV-2 diagnostics because (1) collection is minimally invasive and can reliably be self-administered and (2) saliva has exhibited comparable sensitivity to nasopharyngeal swabs in detection of other respiratory pathogens, including endemic human coronaviruses, in previous studies. To validate the use of saliva for SARS-CoV-2 detection, we tested nasopharyngeal and saliva samples from confirmed COVID-19 patients and self-collected samples from healthcare workers on COVID-19 wards. When we compared SARS-CoV-2 detection from patient-matched nasopharyngeal and saliva samples, we found that saliva yielded greater detection sensitivity and consistency throughout the course of infection. Furthermore, we report less variability in self-sample collection of saliva. Taken together, our findings demonstrate that saliva is a viable and more sensitive alternative to nasopharyngeal swabs and could enable at-home self-administered sample collection for accurate large-scale SARS-CoV-2 testing.

Introduction
Efforts to control SARS-CoV-2, the novel coronavirus causing COVID-19 pandemic, depend on accurate and rapid diagnostic testing. These tests must be ( 1 ) sensitive to mild and asymptomatic infections to promote effective self isolation and reduce transmission within high risk groups; ( 2 ) consistent to reliably monitor disease progression and aid clinical decisions; and ( 3 ) scalable to inform local and national public health policies, such as when social distancing measures can be safely relaxed. However, current SARS-CoV-2 testing strategies often fail to meet these criteria, in part because of their reliance on nasopharyngeal swabs as the widely recommended sample type for real-time RT-PCR.
Although nasopharyngeal swabs are commonly used in respiratory virus diagnostics, they show relatively poor sensitivity for SARS-CoV-2 detection in early infection and are inconsistent during serial testing. Moreover, collecting nasopharyngeal swabs causes discomfort to patients due to the procedure’s invasiveness, limiting compliance for repeat testing, and presents a considerable risk to healthcare workers, because it can induce patients to sneeze or cough, expelling virus particles. The procedure is also not conducive to large-scale testing, because there are widespread shortages of swabs and personal protective equipment for healthcare workers, and self-collection of nasopharyngeal swabs is difficult and less sensitive for virus detection. These challenges will be further exacerbated as the COVID-19 pandemic intensifies in low income countries. Given the limitations, a more reliable and less resource-intensive sample collection method, ideally one that accommodates self-collection in the home, is urgently needed.

Saliva sampling is an appealing alternative to nasopharyngeal swab, since collecting saliva is non-invasive and easy to self-administer. An analysis of nasopharyngeal and saliva concordance for RT-PCR detection of respiratory pathogens, including two seasonal human coronaviruses, suggests comparable diagnostic sensitivity between the two sample types. Preliminary findings indicate that ( 1 ) SARS-CoV-2 can be detected from the saliva of COVID-19 patients and ( 2 ) self-collected saliva samples have comparable SARS-CoV-2 detection sensitivity to nasopharyngeal swabs collected by healthcare workers from mild and subclinical COVID-19 cases. Critically, however, no rigorous evaluation of the sensitivity of SARS-CoV-2 detection in saliva with respect to nasopharyngeal swabs has been conducted from inpatients during the course of COVID-19 infection.

In this study, we evaluated SARS-CoV-2 detection in paired nasopharyngeal swabs and saliva samples collected from COVID-19 inpatients and asymptomatic healthcare workers at moderate-to-high risk of COVID-19 exposure. Our results indicate that using saliva for SARS-CoV-2 detection is more sensitive and consistent than using nasopharyngeal swabs.
Overall, we demonstrate that saliva should be considered as a reliable sample type to alleviate COVID-19 testing demands.

Results
Higher SARS-CoV-2 titers detected from saliva than nasopharyngeal swabs from inpatients
To determine if saliva performs as well as the U.S. CDC recommendation of using
nasopharyngeal swabs for SARS-CoV-2 diagnostics, we collected clinical samples from 44 COVID-19 inpatient study participants ( Table 1 ). This cohort represents a range of COVID-19 patients with severe disease, with 19 (43%) requiring intensive care, 10 (23%) requiring mechanical ventilation, and 2 (5%) deceased as of April 5th, 2020. Using the U.S.
CDC SARS-CoV-2 RT-PCR assay, we tested 121 self-collected saliva or healthcare
worker-administered nasopharyngeal swabs from this cohort. We found strong
concordance between the U.S. CDC “N1” and “N2” primer-probe sets ( Extended Data Fig.
1 ), and thus calculated virus titers (virus copies/mL) using only the “N1” set. From all positive samples tested ( n = 46 nasopharyngeal, 37 saliva), we found that the geometric mean virus titers from saliva were about 5⨉ higher than nasopharyngeal swabs ( p < 0.05, Mann-Whitney test; Fig. 1a ). When limiting our analysis to only patient-matched nasopharyngeal and saliva samples ( n = 38 for each sample type), we found that SARS-CoV-2 titers from saliva were significantly higher than nasopharyngeal swabs ( p = 0.0001, Wilcoxon test; Fig. 1b ). Moreover, we detected SARS-CoV-2 from the saliva but not the nasopharyngeal swabs from eight matching samples (21%), while we only detected SARS-CoV-2 from nasopharyngeal swabs and not saliva from three matched samples (8%; Fig. 1c ). Overall, we found higher SARS-CoV-2 titers from saliva than nasopharyngeal swabs from hospital inpatients.

Table 1. COVID-19 inpatient cohort characteristics

Figure 1. SARS-CoV-2 titers are higher in the saliva than nasopharyngeal swabs from hospital inpatients. ( a ) All positive nasopharyngeal swabs ( n = 46) and saliva samples ( n = 39) were compared by a Mann-Whitney test ( p < 0.05). Bars represent the median and 95% CI. Our assay detection limits for SARS-CoV-2 using the US CDC “N1” assay is at cycle threshold 38, which corresponds to 5,610 virus copies/mL of sample (shown as dotted line and grey area). ( b ) Patient matched samples ( n = 38), represented by the connecting lines, were compared by a Wilcoxon test test ( p < 0.05). ( c ) Patient matched samples ( n = 38) are also represented on a scatter plot. All of the data used to generate this figure, including the raw cycle thresholds, can be found in Supplementary Data 1 . Extended Data Fig. 1 shows the correlation between US CDC assay “N1” and “N2” results.

Less temporal SARS-CoV-2 variability when testing saliva from inpatients
As temporal SARS-CoV-2 diagnostic testing from nasopharyngeal swabs is reported to be variable, we tested longitudinal nasopharyngeal and saliva samples from inpatients to determine which sample type provided more consistent results. From 22 participants with multiple nasopharyngeal swabs and 12 participants with multiple saliva samples, we found that SARS-CoV-2 titers generally decreased in both sample types following the reported date of symptom onset ( Fig. 2a ). Our nasopharyngeal swab results are consistent with previous reports of variable SARS-CoV-2 titers and results: we found 5 instances where a participant’s nasopharyngeal swab was negative for SARS-CoV-2 followed by a positive result during the next collection (5/33 repeats, 33%; Fig. 2b) . In longitudinal saliva collections from 12 patients, however, there were no instances in which a sample tested negative and was later followed by a positive result. As true negative test results are important for clinicians to track patient improvements and for decisions regarding discharges, our data suggests that saliva is a more consistent sample type than nasopharyngeal swabs for monitoring temporal changes in SARS-CoV-2 titers.

Figure 2: SARS-CoV-2 detection is less variable between repeat sample collections with saliva.
(a) Longitudinal SARS-CoV-2 titers from saliva or nasopharyngeal swabs are shown as days since symptom onset. Each circle represents a separate sample, which are connected to additional samples from the same patient by a dashed line. Our assay detection limits for SARS-CoV-2 using the US CDC “N1” assay is at cycle threshold 38, which corresponds to 5,610 virus copies/mL of sample (shown as dotted line and grey area). ( b ) The data are also shown by sampling moment (sequential collection time) to highlight the differences in virus titers between collection points. All of the data used to generate this figure, including the raw cycle thresholds, can be found in Supplementary Data 1.

More consistent self-sampling from healthcare workers using saliva
Validating saliva for the detection of subclinical SARS-CoV-2 infections could prove transformative for both remote patient diagnostics and healthcare worker surveillance. To investigate this, we enrolled 98 asymptomatic healthcare workers into our study and collected saliva and/or nasopharyngeal swabs on average every 2.9 days (range = 1-8 days, Table 2 ). To date, we have detected SARS-CoV-2 in saliva from two healthcare workers who were negative by nasopharyngeal swabs using both the US CDC “N1” and “N2” tests and did not report any symptoms. The saliva from one of these individuals again tested positive alongside a matching negative nasopharyngeal swab upon repeat testing 2 days later. Virus titers from asymptomatic healthcare workers’ saliva are lower than what we typically detect from symptomatic inpatients ( Fig. 3a ), which likely supports the lack of symptoms.

Our limited data supports that saliva may be more sensitive for detecting asymptomatic or pre-symptomatic infections; however, a larger sample size is needed to confirm. As nasopharyngeal swab sampling inconsistency may be one of the potential issues for false negatives ( Fig. 2 ), monitoring an internal control for proper sample collection, human RNase P, may provide an alternative evaluation technique. While human RNase P detection was better from saliva in both the inpatient and healthcare worker cohorts ( Fig. 3b) , this alone may not indicate better virus detection. More importantly, we found that human RNase P detection was more variable from nasopharyngeal swabs collected from inpatients ( p = 0.0001, F test for variances) and self-collected from healthcare workers ( p = 0.0002; Fig. 3b ). Our results suggest that saliva may also be an appropriate, and perhaps more sensitive, alternative to nasopharyngeal swabs for screening asymptomatic or pre-symptomatic SARS-CoV-2 infections.

Table 2. Healthcare worker cohort

Figure 3. Saliva is an alternative for SARS-CoV-2 screening from healthcare workers and asymptomatic cases. ( a ) SARS-CoV-2 titers measured from the saliva of healthcare workers and inpatients. Our assay detection limits for SARS-CoV-2 using the US CDC “N1” assay is at cycle threshold 38, which corresponds to 5,610 virus copies/mL of sample (shown as dotted line and grey area). ( b ) RT-PCR cycle thresholds (Ct) values for human RNase P, and internal control for sample collection, from either inpatients (left panel) or health care workers (right panel) were compared by variances using the F test ( p = 0.0001 for inpatients; p = 0.0002 for healthcare workers). All of the data used to generate this figure, including the raw cycle thresholds, can be found in Supplementary Data 1.

Discussion
Our study demonstrates that saliva is a viable and preferable alternative to nasopharyngeal swabs for SARS-CoV-2 detection. We found that the sensitivity of SARS-CoV-2 detection from saliva is comparable, if not superior to nasopharyngeal swabs in early hospitalization and is more consistent during extended hospitalization and recovery. Moreover, the detection of SARS-CoV-2 from the saliva of two asymptomatic healthcare workers despite negative matched nasopharyngeal swabs suggests that saliva may also be a viable alternative for identifying mild or subclinical infections. With further validation, widespread implementation of saliva sampling could be transformative for public health efforts: saliva self-collection negates the need for direct healthcare worker-patient interaction, a source of several major testing bottlenecks and overall nosocomial infection risk, and alleviates supply demands on swabs and personal protective equipment.

As SARS-CoV-2 viral loads differ between mild and severe cases, a limitation of our study is the primary focus on COVID-19 inpatients, many with severe disease. While more data are required to more rigorously compare the efficacy of saliva in the hospital setting to earlier in the course of infection, findings from two recent studies support its potential for detecting SARS-CoV-2 from both asymptomatic individuals and outpatients. As infectious virus has been detected from the saliva of COVID-19 patients, ascertaining the relationship between virus genome copies and infectious virus particles in the saliva of pre-symptomatic individuals will play a key role in understanding the dynamics of asymptomatic transmission.

Stemming from the promising results for SARS-CoV-2 detection in asymptomatic individuals, a saliva SARS-CoV-2 detection assay has already gained approval through the U.S. Food and Drug Administration emergency use authorization. To meet the growing testing demands, however, our findings support the need for immediate validation and implementation of saliva for SARS-CoV-2 diagnostics in certified clinical laboratories.

Methods
Ethics
All study participants were enrolled and sampled in accordance to the Yale University HIC-approved protocol #2000027690. Demographics, clinical data and samples were only collected after the study participant had acknowledged that they had understood the study protocol and signed the informed consent. All participant information and samples were collected in association with study identifiers.

Participant enrollment
Inpatients
Patients admitted to Yale New Haven Hospital (a 1541-bed tertiary care medical center in New Haven, CT, USA), who tested positive for SARS-CoV-2 by nasopharyngeal and/or oropharyngeal swab (CDC approved assay) were invited to enroll in the research study. Exclusion criteria were age under 18 years, non-English speaking and clinical, radiological or laboratory evidence for a non-infectious cause of fever or respiratory symptoms or a microbiologically-confirmed infectious source (e.g. gastrointestinal, urinary, cardiovascular) other than respiratory tract for symptoms and no suspicion for COVID-19 infection.

Healthcare workers
Asymptomatic healthcare workers (e.g., without fever or respiratory symptoms) with occupational exposure to patients with COVID-19 were invited to enroll in the study. Study participation enabled active surveillance to ensure early detection following exposure and to further protect other healthcare workers and patients.

Sample collection
Inpatients
Nasopharyngeal and saliva samples were obtained every three days throughout their clinical course. Nasopharyngeal samples were taken by registered nurses using the BD universal viral transport (UVT) system. The flexible, mini-tip swab was passed through the patient's nostril until the posterior nasopharynx was reached, left in place for several seconds to absorb secretions then slowly removed while rotating. The swab was placed in the sterile viral transport media (total volume 3 mL) and sealed securely. Saliva samples were self-collected by the patient. Upon waking, patients were asked to avoid food, water and brushing of teeth until the sample was collected. Patients were asked to repeatedly spit into a sterile urine cup until roughly a third full of liquid (excluding bubbles), before securely closing it. All samples were stored at room temperature and transported to the research lab at the Yale School of Public Health within 5 hours of sample collection.

Healthcare workers
Healthcare workers were asked to collect a self-administered nasopharyngeal swab and a saliva sample every three days for a period of 2 weeks. Samples were stored at +4°C until being transported to the research lab.

SARS-CoV-2 detection
On arrival at the research lab, total nucleic acid was extracted from 300 μl of viral transport media from the nasopharyngeal swab or 300 μl of whole saliva using the MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation kit (ThermoFisher Scientific) following the manufacturer's protocol and eluted into 75 μl of elution buffer. For SARS-CoV-2 RNA detection, 5 μl of RNA template was tested as previously described, using the US CDC real-time RT-PCR primer/probe sets for 2019-nCoV_N1 and 2019-nCoV_N2 and the human RNase P (RP) as an extraction control. Samples were classified as positive for SARS-CoV-2 when both N1 and N2 primer-probe sets were detected <38 Ct . Virus copies were quantified using a 10-fold dilution standard curve of RNA transcripts that we previously generated. As results from N1 and N2 were comparable ( Extended Data Fig. 1 ), all virus copies are shown as calculated using the N1 primer-probe set.

Statistical analysis
Statistical analyses were were conducted in GraphPad Prism 8.0.0 as described in the Results.

Acknowledgments
We gratefully acknowledge the study participants for their time and commitment to the study. We thank all members of the clinical team at Yale-New Haven Hospital for their dedication and work which made this study possible. We also thank S. Taylor and P. Jack for technical discussions.

Funding
The study was partially funded by the Yale Institute for Global Health. The corresponding authors had full access to all data in the study and had final responsibility for the decision to submit for publication.

Extended data

Extended Data Fig. 1. Concordance between SARS-CoV-2 detection using US CDC “N1” and “N2” primer and probe sets. Ct = RT-PCR cycle threshold. Dotted line and grey areas indicate the limits of detection.